蛋白质印迹法（即免疫印迹实验，简称WB）在分子生物学、生物化学和免疫遗传学领域中被广泛应用。其基本原理是使用特异性抗体来探测经过凝胶电泳处理的细胞或生物组织样品中的特定蛋白质。通过分析这些蛋白质的着色位置和深度，研究人员可以获取有关所研究细胞或组织中蛋白质表达情况的信息。WB实验是一种经典且有效的技术，适用于定性和定量检测蛋白质的表达情况。其优点在于灵敏度高，检测的下限可达到ng级别，使用发光法可至pg级别，而且操作相对简便，特异性强。然而，由于WB实验步骤较多、操作复杂，常常导致实验者在操作过程中遇到各种问题，如信号弱、条带缺失、非特异性色带及较深背景等，最终未能得到理想的WB结果。因此，在实验过程中应以预防为主，严格按照每一步的要求进行操作。以下列举了一些常见的WB实验问题及其解决方案：

一、无条带

1. 抗体浓度不足：抗体对目标蛋白的亲和力可能较低，建议提高抗体浓度（2-4倍于推荐起始浓度）。可能抗体失去活性，尝试更换新抗体。

2. 样本中蛋白含量低：使用阳性对照确认实验有效性，增加样本中蛋白上样量，采用其他方法评估目的蛋白的存在。

3. 转膜失败：确保NC或PVDF膜与凝胶良好接触。

4. 转膜不完整：优化转膜时间，高分子量蛋白需更长时间，建议使用染色剂确认转膜的有效性。

5. 转膜过度：降低低分子量蛋白（<10kDa）的转移电压或时间。

6. 蛋白等电点大于9：考虑使用pH较高的缓冲系统，如CAPS（pH 10.5）。

7. 二抗错误使用：确认二抗的宿主及亚型。

8. 抗体过期：尝试更换新鲜抗体。

9. 抗体储存不当：请根据供应商建议储存，避免多次冻融。

10. 叠氮化钠污染：确保缓冲液中不含叠氮化钠，因为该物质会抑制HRP信号。

11. 抗体孵育时间不足：建议一抗在4℃下过夜孵育。

二、条带弱

1. 蛋白与抗体结合较弱：建议减少洗涤次数，降低抗体稀释液和洗涤液中的NaCl浓度（推荐0.15M-0.5M）。

2. 抗体浓度不足：酌情增加抗体浓度（2-4倍于推荐起始浓度）。

3. 蛋白量不足：增加样本上样量。

4. 偶联物活性下降：混合酶与底物，若无显色或显色弱需更换新试剂。

5. ECL试剂失效：尝试更换新ECL试剂。

6. 脱脂奶粉可能封闭部分抗原：减少封闭液及抗体稀释液中的奶粉比例或用3% BSA替代。

三、多条带

1. 一抗的非特异结合：降低一抗浓度，减少蛋白上样量或更换特异性更高的单抗。

2. 二抗的非特异结合：用二抗对照，若出现条带则更换其他二抗。

3. 一抗或二抗的非特异结合：在溶液中加入0.1%-0.5% Tween 20，提高洗液中的Tween 20比例并增加洗膜次数。

4. 蛋白聚集：增加DTT用量（20-100mM DTT）以确保二硫键完全还原，并在上样前加热样本于沸水中5-10分钟。

5. 蛋白降解：尽量避免样本反复冻融，样本保存前添加蛋白酶抑制剂或使用新鲜样本。

6. 试剂污染：检查缓冲液是否有微粒或细菌污染，使用新鲜试剂。

四、高背景

1. 一抗的非特异结合：降低一抗浓度，使用5%优质脱脂奶封闭，调整一抗溶液中的奶粉或NaCl浓度。

2. 二抗的非特异结合：用二抗对照，若出现条带则更换其他二抗。

3. 封闭不完全：在封闭液中添加0.1%-0.5% Tween 20，延长封闭时间以增强封闭效果。

4. 脱脂奶粉可能封闭部分抗原：使用3%BSA替代。

5. 脱脂奶粉中的内源性生物素不兼容亲和素：建议使用3%BSA替代。

6. 一些抗体识别奶蛋白：考虑用3%BSA替代。

7. 洗膜不充分：增加洗涤次数并提高洗液中Tween 20的浓度。

8. 胶片曝光过度：减少曝光时间，若目标信号太强，可等5-10分钟再重新曝光胶片。

五、白色条带

1. 过强的信号生成：降低抗体或蛋白浓度以避免造成局部信号过强，导致底物迅速耗尽，从而出现白色条带。

2. ECL显色剂过于灵敏：尝试更换低灵敏度的ECL显色剂。

六、斑驳不平的斑点

1. 试剂污染：检查缓冲液，确保无微粒或细菌污染，使用新鲜试剂。

2. 孵育或洗涤液不足：确保膜完全浸泡在洗液或孵育液中。

3. 膜内气泡：轻轻去除所有气泡。

4. 孵育搅拌不均匀：确保在摇动器上充分搅拌。

5. 设备污染：确认电泳装置清洗干净，去除残留的蛋白或凝胶碎片。

6. 曝光过度：减少曝光时间。

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